Изменение параметров иммунной системы в процессе т-клеточной вакцинации у больных ревматоидным артритом
© 2011 г. И.П. Иванова*, Г.В. Селедцова*, С.В. Мамаев***, Л.С. Литвинова**,
Ю.А. Лопатникова*, С.В. Сенников*, В.И. Селедцов**
* НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия;
** Балтийский федеральный университет им. И. Канта, г. Калининград, Россия;
*** ФМБА ФГУЗ Клиническая больница № 85, г. Москва, Россия
Поступила: 07.07.2011. Принята: 07.10.2011
Пациенты с ревматоидным артритом были пролечены с использованием вакцины, состоящей из аутологичных коллагенреактивных Т-клеток. Установлено, что после иммунотерапевтического курса лечения антиген-специфическая пролиферативная активность мононукле- арных клеток периферической крови пациентов значительно снижалась. Вакцинотерапия приводила также к достоверному снижению уровня IFNy и повышению уровня IL-4 в плазме крови пациентов. В соответствии с этим, у больных после курса лечения Т-клеточной вакциной отмечалось снижение числа IFNy-продуцирующих CD4+ и CD8 + клеток в 1,6 — 1,8 раза, а также параллельное увеличение числа IL-4-продуцирующих CD4+ лимфоцитов в 1,7 раза. Кроме того, в настоящем исследовании показано, что у больных ревматоидным артритом в сравнении со здоровыми лицами содержание CD8 + CD45RO + CD62L — эффекторных Т-клеток памяти и количество центральных CD4+CD45RO + CD62L+ и CD8 + CD45RO + CD62L+ Т-клеток памяти было увеличено в 5 — 7 раз. В процессе лечения у вакцинированных пациентов наблюдалось значительное снижение числа CD4+ и CD8+ центральных Т-клеток памяти, а также уменьшение количества эффекторных CD8+ Т-клеток памяти. Нами обнаружено также, что после вакцинации у больных достоверно увеличивалось количество регуляторных CD4+CD25 + FoxP3+ Т-клеток в периферической крови. Однако количество CD4+CD25 — FoxP3+ Т-клеток существенно не менялось в процессе всего периода лечения. В результате клинического применения Т-клеточной вакцинации клиническое улучшение было достигнуто у 87% пациентов.
Ключевые слова: Т-клетки, вакцина, вматоидный артрит
Введение
Общепринято, что в основе патогенеза ревматоидного артрита (РА) лежит аутоиммунный процесс, опосредуемый Т-хелперами I типа. Специфическое распознавание Т-лимфоцитами антигенных молекул, экспрессирующихся на синовиальных суставных поверхностях, запускает цепь событий, приводящих к воспалению и разрушению суставов [1, 2].
Аутореактивные Т-клетки, распознающие собственные антигены, являются составной частью иммунной системы здорового организма. Это значит, что посттимические механизмы контролируют эти аутоагрессивные Т-клетки и обеспечивают защиту от них. Такая регуляция может включать периферическую клональную делецию, модуляцию антагонистами цитокинов, ингибицию взаимодействия идиотипов T-клеточных рецепторов (ТКР). Нарушенная регуляторная сеть приводит к нарушению подавления активированных аутоиммунных клеток и развитию аутоиммунного заболевания [2 — 4].
Является очевидным, что иммунотропное лечение РА должно быть направлено на инактивацию аутоиммунных Т- и В-лимфоцитов, усиление активности естественных и индуцированных регуляторных Т-клеток, подавление продукции провоспалительных медиаторов.
Т-клеточная вакцинация (ТКВ) — введение ослабленных аутореактивных Т-клеток — включает многие регуляторные механизмы иммунного ответа:
— ТКВ индуцирует антиклонотипические Т-клетки. Они регулируют патогенные Т-клетки через распознавание клонотипических детерминант (идиотипов), т.е. антиидиотипический ответ. В основном, это цитотоксические CD8 + Т-клетки, рестриктированные по молекулам МНС I класса. Меньшую долю составляют антиидиотипические CD4+ Т-клетки. Эти клетки не цитотоксичны для аутореактивных клеток, но ингибируют их пролиферацию, распознавая идиотипические детерминанты в комплексе с молекулами гистосовместимости II класса. Они могут принадлежать к разным типам Т-лимфоцитов: TH2 — продуцентам IL-4; TH3- продуцентам TGFp 5.
— ТКВ также затрагивает функцию естественных CD4 + CD25+ регуляторных Т-клеток (Treg). Имеются данные, предполагающие, что часть этих клеток обладает специфичностью к ТКР и исходно вовлечена в идиотипантиодиотипическую иммунорегуляцию. Это означает, что Т-клеточная вакцинация может создавать благоприятные условия для экспансии CD4+CD25+ T reg, специфичных к вакцинальным ТКР [8].
— ТКВ воздействует на антиэрготипическую регуляцию Т-клеточных реакций, которая не связана с распознаванием идиотипических детерминанат. Независимо от своей антигенной специфичности, антиэрготипические Т-клетки реагируют только на активированные, а не покоящиеся аутореактивные Т-клетки [4, 9].
— ТКВ индуцирует не только Т-, но и В- клеточные реакции, а именно, образование антиидиотипических антител, которые связываются и ингибируют аутореактивные Т-клеточные клоны. Они относятся к IgG, распознают ТКР-детерминанты вне зависимости от молекул главного комплекса гистосовестимости. Механизм действия таких антител может быть связан с экранированием и функциональной блокадой ТКР [10].
Таким образом, имеющиеся экспериментальные и клинические данные дают основание полагать, что ТКВ может стать эффективным методом лечения аутоиммунных заболеваний, имеющим большой потенциал для своего дальнейшего развития [11, 12].
Целью настоящей работы было исследование иммунологических и клинических аспектов применения Т-клеточной вакцинации у больных РА.
Материалы и методы
Технология получения Т-клеточной вакцины
Разработанная нами технология получения Т-клеточной вакцины состоит из двух последовательных этапов. Первый этап включает в себя специфическую селекцию клеток, тогда как второй — их наращивание в необходимом количестве [13, 14]. На первом этапе выделенные из периферической крови мононуклеарные клетки (МНК) пациентов культивировали в концентрации 2×10 6 мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной аутологичной плазмы, 5 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 5×10 -5 М меркаптоэтанола (все реагенты компании «Sigma», США) в присутствии синовиальных (1 мкг/мл) и хрящевых (1 мкг/мл) антигенов в течение 5— 7 дней во влажной атмосфере с 5% СО2. Хрящевые и синовиальные белковые антигены получены из суставных тканей свиньи. Антиген хрящевой ткани выделяли методом, описанным Strom S.C. [15]. Синовиальный белковый антиген получали путем центрифугирования синовиальной жидкости. На втором этапе антигенспецифические клетки наращивали посредством их стимуляции фитогемагглютинином (ФГА, 5 мкг/мл, «Sigma») и рекомбинантным IL-2 (100 ед/мл, «Биотех», Санкт- Петербург) в течение 5 дней. По завершению культивирования клетки инактивировали, далее криоконсервировали стандартным путем в плазме с 10% диметилсульфоксида («Sigma») и хранили в жидком азоте до момента использования. Общее количество полученных от одного больного клеток вакцины варьировало в пределах 18—27×10 7 .
Пролиферативный ответ полученных таким образом вакцинальных клеток на хрящевые и синовиальные антигены превышал контрольные значения 1,8 — 2,0 раза. В процессе культивирования число IFNy-продуцирующих CD4+ и CD8+ Т-клеток увеличивалось от 3 до 10 раз, содержание CD3 + СD45RO+ Т-клеток памяти увеличивалось в 2 раза, а содержание CD3 + СD45RА+ — в 1,3 раза [16].
Оценка пролиферативного ответа МНК
Для оценки антиген-индуцированного пролиферативного ответа МНК культивировали в 96-луночном планшете в концентрации 2×10 5 в полной среде в присутствии хрящевых (1 мкг/мл) и синовиальных (1 мкг/мл) антигенов либо без них в течение 5 дней во влажной атмосфере с 5% СО2. Клеточная пролиферация учитывалась стандарным методом по включению [ 3 Н] тимидина.
Определение цитокинов в плазме крови и культуральных жидкостях
Количественное содержание цитокинов — IFNy и IL-4 в образцах плазмы крови и супернатантах 72-часовых культур МНК оценивали иммуноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем компании «Вектор-Бест» (п. Кольцово, Новосибирская область).
Оценка содержания IFNy- и IL-4 — продуцирующих лимфоцитов
Количество IFNy- и IL-4- продуцирующих лимфоцитов оценивали с помощью метода определения внутриклеточных цитокинов после 4 ч культивирования МНК периферической крови в присутствии форболового эфира, иономицина и брефелдина А. По окончании периода культивации клетки обрабатывали моноклональными антителами к поверхностным маркерам (CD4 и CD8) и после фиксации и пермеабилизации инкубировали в присутствии моноклональных антител (МА) к IFNy и IL-4 (все реактивы «Becton Dickinson», США). После отмывки клетки анализировали на проточном цитометре.
Определение содержания Т-клеток памяти
Относительное содержание клеток памяти определяли методом 3-цветной проточной цитофлюориметриии с помощью меченных фикоэритрином (РЕ) МА к CD4 и CD8 («Сорбент», Москва), конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) МА к CD45RO («eBioscience», США), меченных аллофикоцианином (APC) анти-CD62L МА («eBioscience», США). По наличию или отсутствию на клеточной поверхности соответствующих молекул определяли следующие клеточные популяции: наивные клетки — (CD45RO»CD62L + ), центральные клетки памяти — (CD45RO+CD62L+), эффекторные клетки памяти — (CD45RO+CD62L«). В тексте указан процент каждой популяции от общего числа лимфоцитов.
Определение содержания регуляторных Т-клеток
Поверхностные маркеры регуляторных (CD4 + CD25 + FoxP3 + ) клеток определяли с помощью МА к CD4, меченных АРС; МА к IL-2 рецептору (CD25), конъюгированных с FITC. Экспрессию FoxP3 оценивали с использованием МА, меченных РЕ (все реактивы «Becton Dickinson», США). Процент позитивных от общего числа лимфоцитов клеток определяли на проточном цитометре «FACS Calibur».
Клинические исследования
Клинические и экспериментальные исследования проводили в соответствии с протоколом, утвержденным Ученым советом и Этическим комитетом Института клинической иммунологии СО РАМН. От каждого пациента, участвующего в исследовании, было получено информированное согласие. Иммунотерапевтическое лечение было проведено 42 больным РА (37 женщин, 5 мужчин) в возрасте от 28 до 58 лет с давностью заболевания не менее 2 лет. Клинические испытания проводили на базе ФМБА ФГУЗ Клинической больницы № 85, г. Москва. Все пациенты получали базисную терапию метотрексатом в дозе не более 10 мг в неделю. Дополнительно схема лечения Т-клеточной вакциной включала в себя 4 еженедельных подкожных вакцинации (индуцирующий курс) и последующие вакцинации с интервалом в 1 месяц. Вакцинальная доза варьировала в пределах 2,0 — 4,0×10 7 клеток. Для оценки эффективности лечения Т-клеточной вакциной использовали критерии Европейской антиревматической лиги (EULAR), основанные на динамике DAS 28 [19]. Кроме того, анализировали отдельные показатели активности РА: интенсивность боли, длительность утренней скованности, число болезненных и число припухших суставов, СОЭ, параметры качества жизни (HAQ).
Для иммунологического исследования составили контрольную группу из 10 здоровых доноров, сопоставимых по возрасту.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, парного критерия Вилкоксона.
Результаты
Рис. 1. Пролиферативный ответ МНК периферической крови больных РА (n = 12) на специфические антигены (хрящевой и синовиальный) до и через 1 год после начала лечения.
** Р + CD45Ro + Cd62L» эффекторных клеток памяти было увеличено в 5 раз, а количество центральных клеток памяти CD45RO+CD62L+ было увеличено как среди CD4+, так и среди CD8+ Т-клеток. Наши данные указывают, что при РА может иметь место ускоренная диффе- ренцировка «наивных» клеток в центральные CD4+ и CD8+ Т-клетки и цитотоксические эффекторные CD8+ Т-клетки, которая отражает антигенспецифическую экспансию Т-клеток в ответ на повторные, системные воздействия антигена [17, 18].
Рис. 3. Содержание IFNy и IL-4-продуцирующих лимфоцитов (CD4 и CD8) в периферической крови больных РА (n = 7) до и после индуцирующего курса лечения.
* P + CD25 — FoxP3+ Т-клеток, то их число существенно не меняется в процессе всего периода лечения.
Результаты клинических испытаний
Таблица 1. Содержание субпопуляций Т-клеток у больных РА в процессе лечения Т-клеточной вакциной (M ± m)
Источник статьи: http://transplantation.ru/stati/izmenenie-parametrov-immunnoj-sistemy-v-processe-t-kletoc.html